-
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基
产品概述：
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基
（BiozellenCM® Mouse Gastric Epithelial Organoid Growth Medium）
Catalog No B-MM-00003-100、 B-MM-00003-500
Specification 100ml、500ml
一、产品介绍
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基是一种化学成份明确的无血清培养基，用于从肠道组织样本建立小鼠胃上皮类器官。小鼠胃上皮类器官包含LGR5+干细胞、黏液细胞、主细胞和少量的内分泌细胞。因此，类器官在结构、细胞类型组成和自我更新等方面具有胃上皮的生物特征，可用于肠道疾病模型，药物测试，以及胃上皮功能等研究。
二、产品信息
组 成 | 货 号 | 规 格 | 储存温度&质保期 |
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官基础培养基 | B-MM-00003 | 100 ml/500ml | 2-8 ℃，12个月 |
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基添加剂 A (50×) | B-MM-00003-A | 2 ml/10ml | -20℃，12 个月，避免反复冻融 |
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基添加剂 B (50×) | B-MM-00003-B | 2 ml/10ml | -20℃，12个月，避免反复冻融 |
BiozellenCM® 小鼠胃上皮类器官培养基添加剂 C (100×) | B-MM-00003-C | 1 ml/5ml | -20℃，12个月，避免反复冻融 |
三、胃上皮类器官扩增培养基和维持培养配置
1. 首次使用时，冰上解冻小鼠胃上皮类器官培养基添加剂A、B和C，解冻后的添加剂或一次性配置并使用，或分装于-20℃冻存；
2. 小鼠胃上皮类器官扩增培养基配置：按比例将添加 A、B 和 C 至小鼠胃上皮类器官基础培养基中，混匀后置于 2-8 ℃保存，建议 2-3 周内使用。
（以 10mL 为例：200μL 添加剂 A + 200μL 添加剂 B + 100 μL 添加剂 C + 9.5 mL 小鼠胃上皮类器官基础培养基）
3. 小鼠胃上皮类器官维持培养基配置：按比例将添加 A 和 B 至小鼠胃上皮类器官基础培养基中，混匀后置于 2-8 ℃保存，建议 2-3 周内使用。
（以 10mL 为例：200μL 添加剂 A + 200μL 添加剂 B + 9.6 mL 小鼠胃上皮类器官基础培养基）
四、 需要但不包含的其他试剂与耗材
名 称 | 货 号 | 规 格 |
组织保存液 | B-R-00005-100 | 100 ml/瓶 |
BiozellenGel 基质胶，低因子，无酚红 | B-P-00007-10 | 10 ml/瓶 |
类器官传代消化液 | B-R-00002-100 | 100 ml/瓶 |
类器官冻存液 | B-R-00006-100 | 100 ml/瓶 |
PBS（含5mM EDTA）缓冲液 | - | - |
无菌PBS（1×） | - | - |
100μm滤网 | - | - |
五、小鼠胃上皮类器官构建操作步骤
1. 组织运输：将采集的组织放入装有组织保存液（B-R-00005-100）的采集管中，充分浸没并于低温（建议冰上）迅速运至实验室。
2. 组织前处理：将组织至于 6 孔板中，加入 PBS （含 1% 双抗和两性霉素 B）漂洗5-10次。
3. 组织剪碎：将组织转移至 10 cm 的无菌培养皿中，剪碎至肉糜状（1-3 mm3）后移入50 mL离心管中。
4. 组织解离：加入 25 mL 含 5mM EDTA 的 PBS 溶液中，冰上孵育 30 min。
备注 1：为充分解离，建议将冰盒放置于摇床上震荡解离（20rpm）。
5. 碎片沉降：将离心管室温沉降约1min，待组织碎片沉降后，小心吸弃上清（无需吸干所有上清，可保留少量液体浸没组织碎片）。
6. 隐窝富集：吸取 5mL PBS 缓冲液，用 1mL 移液枪反复吹打混匀（不少于10次），静置待组织碎片沉降到离心管底部。收集上清至一新的 15mL 离心管中
7. 隐窝富集：重复上述步骤1-2次（吸取 5mL PBS 缓冲液，用 1mL 移液枪反复吹打混匀（不少于10次），静置待组织碎片沉降到离心管底部。收集上清至上述新的15mL 离心管中）
8. 过滤：将收集的 15mL 隐窝富集液通过 100 μm 细胞滤网过滤至新的 50mL 离心管中。
9. 隐窝计数：取1mL 过滤后的隐窝悬液，在显微镜下计数。计数完成过后以 300 g 离心 4 min，吸弃上清。
10. 细胞预冷：取少量类器官培养基（30-50μL）重悬离心收集的隐窝，并放置于冰上预冷。
11. 细胞接种：（整个过程在冰上进行）预冷枪头并吸取适量的 BiozellenGel (B-P-00007-10，或Matrigel) 小心混匀上述预冷的细胞悬液，以 30μL/滴接种至预热细胞孔板中。
备注 3：接种密度推荐 50-300个隐窝/30uL（仅供参考，可按实验需求进行调整）。
备注 4：为保证基质胶固化成胶，建议基质胶体积比例不低于70%。
12. 基质胶固化：接种完成后迅速将接种后的细胞孔板翻转，置于37℃，5% CO2 培养箱内孵育 10-15 min 使基质胶凝固。
13. 培养：待基质胶凝固后，加入准备好的小鼠胃上皮类器官扩增培养基至浸没基质胶滴（需确认小鼠胃上皮类器官培养基中已加入添加剂 A、B和C）。
备注 5：6 孔板建议加入 2.5mL，12 孔板建议加入1.2 mL, 24孔板建议加入 600μL。
备注 6：加液时建议沿侧壁缓慢加入，请勿将培养基直接加到胶滴上。
14. 换液：将接种孔板转移至 37℃，5% CO2 培养箱内培养。观察类器官的培养情况，适时进行换液或传代（建议每2-3天全换或半换液）
六、小鼠胃上皮类器官传代操作步骤
1. 收集：用 1 mL 移液枪头捣碎并刮取基质胶团，并将胶滴与培养基一起转入15 mL离心管中（如孔内有细胞存留，可另吸取 PBS 涮洗孔板并转入离心管中）。 300 g 离心 4 min，小心吸弃上清。
备注 1：建议待大部分类器官的大小大于100 μm 传代（传代标准仅供参考，可按实验需求调整）。
备注 2：为避免枪头粘附性损耗，可用抗粘附液（B-R-00007-100）润洗 移液枪头。
2. 消化：加入 5 mL 类器官传代消化液（B-R-00002-100） 于 37℃ 消化 5-10 min，期间颠倒混匀若干次。
备注 3：在消化过程中，可使用移液器吹打混匀帮助消化。也可实时取少量消化悬液于显微镜下观察消化情况，当观察到较多的单细胞或直径在 50μm 以下的细胞簇后，即可认为消化完成。
3. 终止消化：加入 5-10 mL DMEM/F12 (10 % FBS)，于 300 g 离心 4 min，小心吸弃上清。
4. 细胞漂洗：取 5-10 mL PBS 重悬细胞，300 g 离心 4 min，小心吸弃上清
5. 细胞预冷：取少量类器官培养基（30-50μL）重悬底部细胞，并放置于冰上预冷。
6. 细胞接种：（整个过程在冰上进行）预冷枪头并吸取适量的 BiozellenGel (B-P-00007-10，或Matrigel) 小心混匀上述预冷的细胞悬液，以 30μL/滴接种至预热细胞孔板中。
备注 4：传代比例一般1:2 或 1:3 （传代比例仅供参考，可按实验需求调整）
备注 5：为保证基质胶固化成胶，建议基质胶体积比例不低于70%。
7. 基质胶固化：接种完成后迅速将接种后的细胞孔板翻转，置于37℃，5% CO2 培养箱内孵育 10-15 min 使基质胶凝固。
8. 培养：待基质胶凝固后，加入准备好的小鼠胃上皮类器官维持培养基至浸没基质胶滴（需确认小鼠胃上皮类器官培养基中已加入添加剂 A 和 B）。
9. 换液：将已接种的孔板转移至 37℃，5% CO2 培养箱内培养。镜下观察类器官的培养情况，适时进行换液或传代（建议每2-3天全换或半换液）。
七、友情提示
1. 本试剂仅供科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。
2. 本试剂培养结果会收到标本质量、培养条件等因素影响，同时也受到技术员操作习惯、操作环境以及当前细胞生物学技术局限性等限制，因此可能会存在培养失败的情况。
3. 如遇到特殊样本或其他未涉及问题，请联系公司售后技术支持，我们将提供免费的技术咨询服务，再次感谢您的信任!
