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BiozellenFF 人多能干细胞培养基
产品概述：
BiozellenCM® 人多能干细胞培养基
（BiozellenCM® Human Pluripotent Stem Cell Medium）
Catalog No B-SM-00002-500
Specification 500ml
Storage 2-8℃ ， 12个月
一、产品介绍
BiozellenCM® 人多能干细胞培养基是一款配方优化、化学成分明确、专用于无饲养层培养体系下的人类诱导多能干细胞 (Induced pluripotent stem cells, iPSCs) 或人类胚胎干细胞 (Human embryonic stem cell) 的无血清培养液。本产品有助于干细胞克隆的快速形成和扩展(Colony formation and expansion)，并且连续传代 50 次后其自我更新能力和未分化状态无改变。
二、产品信息
名称 | 货 号 | 规 格 | 储存温度&质保期 |
BiozellenCM® 人多能干细胞基础培养基 | B-SM-00002-500 | 500 mL | 2-8℃，避光保存12 个月 |
BiozellenCM® 人多能干细胞培养基添加剂（50×） | B-SM-00002-A | 10 mL | -20℃，避光保存12 个月 |
三、用前须知
1. 初次使用时，37℃水浴解冻人多能干细胞培养基添加剂（B-SM-00002-A），解冻后的各组分试剂或一次性配置并使用，或分装于-20℃冻存（不超过12个月）；
2. 人多能干细胞培养基配置：按照2% 的比例，将解冻后的人多能干细胞培养基添加剂（B-SM-00002-A）添加至人多能干细胞基础培养基中，混匀后置于 2-8 ℃避光保存，建议 1个月内使用。如规定时间内不能用尽，建议分装于-20℃冻存（不超过12个月）。
四、iPSC 培养方法步骤
1、基质胶分装与孔板包被
（1）. 应分装和冷冻保存 BiozellenGel 干细胞基质胶（B-P-00011-10），分装后的小包装可在-20°C 下最多储存24 个月。
（2）. 提前一天将分装的基质胶至于4°C冰箱中解冻。解冻后的基质胶凝胶始终置于冰上，并使用预先冷却的培养基和移液器，以避免产品凝胶化。
（3）. 用预冷的DMEM/F12 基础培养基稀释基质胶（稀释比例为1:50），以 1mL/孔加入预冷的 6 孔板中，轻轻摇动板子以确保混合液均匀地覆盖在板上。
（4）. 将 6 孔板转移到37°C的培养箱中至少孵育1h。 在培养板可供使用之前，请勿移除包被液。如不立即使用，可将包被孔板密封，放置于2-8 ℃最多储存7 天。
（5）.使用前吸弃包被液。如已将培养板在 2 - 8℃下储存，则在移除包被液之前，将培养板在培养箱 (37℃) 下放置 30 min。
2、iPSC 细胞复苏
（1） 将 iPSC冻存管放在 37 °C 的水浴中快速融化细胞，并在水浴时不停摇晃冷冻管，以确保快速解冻。
（2） 开盖前用 75％乙醇或等效消毒剂对冷冻管进行消毒。
（3） 用无菌移液管将冷冻保护剂 / 细胞混合物转移到15 mL离心管中。再吸6 mL 预温的人多能干细胞培养基，并轻柔混匀。
（4） 将细胞以300 x g 离心 3 min，小心吸弃上清液。
（5）用含有Y27632的培养基（终浓度10μM）轻轻重悬 iPSC，然后将其转移到铺好的 6 孔板中。轻轻摇动板子以均匀分布细胞；
（6） 将 6 孔板放回 37°C 的培养箱中培养；
（7）. 每天更换培养基(不含Y27632)。在解冻后大约 5 - 7 天内检查可进行传代的未分化集落（有密集的中心）。
3、iPSC细胞传代
当细胞集落变得较大、中心变得密集和明亮（对比其边缘）而相邻的集落开始融合时，这时可进行传代。根据接种的细胞团的大小和密度，传代周期为 5 天左右。如果太早对集落进行传代或传代太过频繁，则细胞可能吸附不好、产量将会减少且细胞可能分化。如果太晚对集落进行传代，培养物将开始显示分化迹象（特点是细胞类型出现不同的形态）。
（1） 将无菌DPBS、温和型细胞消化液（B-SM-00003-100）和人多能干细胞培养基温热至室温。
（2） 吸弃培养基，小心加入 2 mL DPBS 缓冲液漂洗细胞，稍晃匀后即吸弃漂洗液。
（3） 向每孔加入1 mL 温和型细胞消化液。将板在 37°C 下孵育 3-5 min。
（4） 当显微镜下观察大部分细胞变圆、脱落时，小心加入 5 mL DMEM/F-12或人多能干细胞培养基终止。
（5） 使用移液枪小心吹打吹打孔底细胞，并将细胞悬液吸取至15 mL离心管中，300 x g 离心 3 min，小心吸弃上清液。
（6） 根据传代比例，吸取适量的含有10 μM Y27632的人多能干细胞培养基重悬细胞，并接种至新的包被孔板中。
备注：一般传代周期为 5 天左右，传代比例为 1：3-1：6。如果集落过于密集或过于稀疏，则下一次传代时相应地调整传代比例。
（7） 每天更换培养基(不含Y27632)。
4、iPSC细胞冻存
（1） 准备无菌细胞冻存管、程序性冻存盒；DPBS、温和型细胞消化液（B-SM-00003-100）、无血清细胞冻存液和人多能干细胞培养基提前温热至室温。
（2） 为提高冻存活率，建议对处于对数生长期（汇合度70-80％）的人多能干细胞培养基进行冻存操作。
（3） 取出细胞培养孔板，吸弃培养基后加入 DPBS 漂洗细胞一次。
（4） 向每孔加入1 mL 温和型细胞消化液。 将板在 37°C 下孵育 3-5 min。
（5） 当显微镜下观察大部分细胞变圆、脱落时，小心加入 5 mL DMEM/F-12或人多能干细胞培养基中和。
（6） 使用移液枪小心吹打吹打孔底细胞，并将细胞悬液吸取至15 mL离心管中，300 x g 离心 3 min，小心吸弃上清液。
（7）. 将细胞重悬于 1mL 含有10 μM Y27632的人多能干细胞培养基中，取10μL细胞悬液计数。
（8） 300 x g 离心 3 min，小心吸弃上清液。根据细胞总数加入适量预冷的无血清细胞冻存液（含10 μM Y27632），重悬后以 1mL分装至细胞冻存管中。
备注：建议冻存比例为1-2 × 106 /管。
5、 将细胞冻存管放入程序性冻存盒中，并转移到-80°C的超低温冰箱中过夜。将细胞再转移至液氮灌中。
