Annexin V-Alexa Fluor 647/PI细胞凋亡检测试剂盒

包装规格                             

产品货号：647020、647050、647100

规格：20T、50T、100T

储存条件

4ºC保存，一年有效

所需实验器材：

微量移液器；PBS；不含EDTA的胰酶消化液；低速离心机；流式细胞仪 

试剂盒组份：

操作说明：

1. 细胞样品的准备：

1. 悬浮细胞：

   1）收集细胞至离心管中1000-2000rpm离心5min，小心去除上清。

   2）用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

   3）再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

2. 贴壁细胞：

   1）吸出细胞培养液至离心管中，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

   2）室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

   3）加入以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

   注：加入的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-Alexa Fluor 647导致染色失败。

   4）用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

   5）再加入1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

2. 用去离子水按1：4稀释Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去离子水）；

3. 用250ml结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；

4. 取100ml的细胞悬液于5 ml流式管中，加入5ml Annexin V-Alexa Fluor 647，轻轻混匀；

5. 室温(20-25oC)避光孵育10min；

6. 上机前5min加入10ml 碘化丙啶溶液，轻轻混匀；

7. 上机前在反应管中补加400ml PBS重悬细胞， 避光保存，随即进行流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V-Alexa Fluor 647和PI均为红色荧光。

图2. 流式细胞仪检测早期凋亡细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。 

注意事项：

1. 此试剂盒仅供研究使用。

2. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

4. Annexin V-Alexa Fluor 647中含有剧毒成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

5. 本试剂盒用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1x106。

6. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

7. Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

8. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-Alexa Fluor 647，最终导致染色失败。

9. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

    

只能用于科学研究使用，禁止用于人、动物或者其它用途